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簡(jiǎn)要描述：基因敲除（Knockout, KO）小鼠是研究基因功能的核心工具，通過(guò)完全或條件性刪除目標(biāo)基因，模擬人類疾病或探索基因機(jī)制
更新時(shí)間：2025-06-26 17:13:14
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| 方法 | 周期 | 成本 | 適用場(chǎng)景 | 優(yōu)勢(shì)/劣勢(shì) |
|---|---|---|---|---|
| CRISPR-Cas9 | 2-4個(gè)月 | 低至中 | 簡(jiǎn)單敲除、短片段插入 | 快、成本低，但可能脫靶 |
| ES細(xì)胞同源重組 | 6-12個(gè)月 | 高 | 復(fù)雜修飾（如條件性KO、大片段替換） | 精準(zhǔn)，但周期長(zhǎng)、需顯微操作 |
| Base Editing | 3-5個(gè)月 | 中至高 | 單堿基敲除（無(wú)DSB） | 避免雙鏈斷裂，但效率較低 |
靶點(diǎn)選擇：
針對(duì)目標(biāo)基因的外顯子（優(yōu)先選擇首ge編碼外顯子）。
使用在線工具（如Benchling或CRISPR Design）避免脫靶。
合成gRNA：化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄（需加5'端G增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率）。
供體DNA：若需同時(shí)插入報(bào)告基因（如GFP），需設(shè)計(jì)同源臂（~800 bp）。
注射混合物：
Cas9 mRNA（50 ng/μL） + gRNA（25 ng/μL） ± 供體DNA（100 ng/μL）。
胚胎操作：
注射C57BL/6或BALB/c品系受精卵（原核期）。
移植至假孕母鼠子宮（約30個(gè)胚胎/母鼠）。
F0代篩查：
PCR + 測(cè)序：檢測(cè)Indel突變（引物設(shè)計(jì)在gRNA靶點(diǎn)外）。
T7E1或Surveyor assay：快速檢測(cè)切割效率。
傳代驗(yàn)證：F0可能為嵌合體，需與野生型交配獲得F1雜合子。
完quanKO驗(yàn)證：qPCR/Western blot確認(rèn)基因表達(dá)缺失。
表型檢測(cè)：根據(jù)基因功能設(shè)計(jì)（如代謝、行為學(xué)、病理分析）。
同源臂：5'和3'臂各1.5-3 kb， flanking 目標(biāo)外顯子。
篩選標(biāo)記：NeoR（正選擇）和TK（負(fù)選擇，如HSV-TK）。
電轉(zhuǎn)遞送：將線性化載體轉(zhuǎn)入JM8或E14 ES細(xì)胞。
藥物篩選：G418（NeoR） + 更xi洛韋（TK陰性篩選）。
顯微注射：將陽(yáng)性ES細(xì)胞注入C57BL/6囊胚。
嵌合體鑒定：毛色嵌合（如129 ES細(xì)胞→B6母鼠）。
嵌合體（公鼠）與野生型交配，篩選后代基因型。
設(shè)計(jì)floxed小鼠：
在目標(biāo)外顯子兩側(cè)插入loxP位點(diǎn)（需同源重組或CRISPR-HDR）。
與Cre小鼠交配：
選擇組織特異性Cre品系（如Alb-Cre用于肝臟敲除）。
驗(yàn)證敲除效率：
在目標(biāo)組織中檢測(cè)基因缺失（避免全身性表型干擾）。
| 問(wèn)題 | 原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| F0無(wú)突變 | gRNA效率低或Cas9活性不足 | 優(yōu)化gRNA設(shè)計(jì)，提高注射濃度 |
| 嵌合體不傳代 | ES細(xì)胞貢獻(xiàn)不足 | 改用高貢獻(xiàn)率ES細(xì)胞系（如JM8A3.N1） |
| 非預(yù)期表型 | 脫靶效應(yīng)或相鄰基因影響 | 多獨(dú)立品系驗(yàn)證，全基因組測(cè)序排查 |
| 條件性KO不完quan | Cre表達(dá)效率低 | 換用強(qiáng)效Cre品系（如UBC-CreERT2） |
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